Practica 4: Lectura de placa inmuno difusión radial de determinación de Ig M, Ig G e Ig A

Lectura de placa inmuno difusión radial de determinación de Ig M, Ig G, Ig A (10/10/2019)

• Objetivo:

En esta práctica lo que se pretende obtener es la determinación de la proteína por inmunodifusión radial ya que la proteína que se desea analizar, al difundir en gel de agarosa en el que se ha disuelto el anticuerpo específico, forma un inmunocomplejo visible como un anillo alrededor del pocillo de siembra.

• Fundamento:

La proteína que se va a analizar, al difundir por el gel de agarosa en el que se ha disuelto el anticuerpo específico forma un inmunocomplejo visible como un anillo alrededor del pocillo de siembra. 

El diámetro de este analito es proporcional a la concentración de la proteína analizada.

Esta proporcionalidad está en función del tiempo de migración.

• Materiales:

-Gradilla

-Tubos Eppendorfs que contienen suero.

-Placa (Ig A, Ig M, Ig G)

-Micropipeta (Dispensamos 1 microlitro)

-Puntas blancas de micropipetas

-Recipiente para depositar las puntas usadas

-Soporte de pipetas

• Procedimiento:

Esta práctica la hemos realizado como las anteriores por grupos de inmunoglobulinas. Lo que hemos hecho en primer lugar ha sido ver en que consistía la práctica con ejemplo de la profesora y así poder entenderlo. Después cada grupo ha realizado la técnica en sus respectivas placas. Estas estuvieron atemperándose nada más que llegamos del recreo.

A continuación lo que hicimos fue preparar los materiales mencionados anteriormente.

Una vez todo listo procedimos de manera que tomamos 1 microlito de cada uno de los sueros contenidos en los 5 tubos Eppendorfs y depositarlos en los pocillos de siembra de la placa, a nivel de la Ig A, Ig M y de la Ig G. Cuando ya habíamos depositado el volumen de suero en todos los pocillos de la placa tuvimos que dejarlo reposar. 

El tiempo de difusión y con ello el tiempo de lectura depende de la concentración y del tipo de la proteína analizada. En general, después de 72 horas, la difusión de cualquier proteína habrá finalizado.

Nosotros lo hicimos el jueves 10 y lo hemos revisado el lunes 14. 

• Conclusión. Incidencias.

Pasado los tres días hasta revisar las placas y hacer la correspondiente lectura, mi grupo de inmunoglobulina A y yo nos hemos dado cuenta de que apenas se puede ver o cuantificar del diámetro formado alrededor de cada pocillo de siembra. Esto no solo ha ocurrido a mi grupo y se ha llegado a la conclusión de que quizás depositamos poco volumen de suero. En el protocolo indicaba 5 microlitros pero hubo compañeras que lo intentaron y se salía del pocillo, entonces optamos por tomar 1 microlitro y pensamos que nos hemos quedado corto.

El resultado que hemos obtenido mi grupo y yo al realizar la placa ha sido el siguiente:

Inmunoglobulinas	Pocillo 1	Pocillo 2	Pocillo 3	Pocillo 4	Pocillo 5
Ig A	No se puede leer	4 mm.	4 mm.	4 mm.	3 mm.
	Pocillo 6	Pocillo 7	Pocillo 8	Pocillo 9	Pocillo 10
Ig G	No se puede leer	3 mm.	4 mm.	3 mm.	4 mm.
	Pocillo 11	Pocillo 12	Pocillo 13	Pocillo 14	Pocillo 15
Ig M	No se puede leer	No se puede leer	No se puede leer	3 mm.	3 mm.