Práctica 5: Prueba para la detección cualitativa del antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B

Prueba rápida para la detección cualitativa del antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B (10/10/2019)

• Objetivo:

El objetivo de esta práctica es poder determinar en las muestras sanguíneas extraídas anteriormente la presencia o no del antígeno del virus de la Hepatitis B.

• Fundamento:

Linear HBsAg cassette es un inmunoensayo cualitativo de membrana para la detección del antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B en suero o plasma humano a una concentración igual o superior a 1 ng/ml. 

La membrana está recubierta por anticuerpos anti-HBsAg en la región de la banda de la prueba.

• Materiales:

-Tubos Eppendorf que contienen suero (5 tubos)

-Gradilla de tubos Eppendorf

-Pipeta desechable

-Linear HBsAg cassette

-Papel de filtro

• Procedimiento:

Hay que atemperar, a temperatura ambiente (20-30ºC) el dispositivo, la muestra y/o controles antes del uso.

1. Sacar el cassette de la bolsa sellada y usarlo lo antes posible.
2. Colocar el cassette en una superficie plana y limpia.
3. Usar la pipeta desechable incluida y dispensar, 2-3 gotas de muestra de suero en el hoyo S y poner en marcha el cronómetro. Hay que evitar atrapar burbujas de aire en la muestra S, no agregar ninguna solución en el área de resultados.
4. A medida que la prueba comienza a trabajar, el color migra a través de la membrana.
5. Esperar a que aparezca la línea de color rojo. Leer los resultados a los 15 minutos de iniciar la prueba. No interpretar los resultados pasados 20 minutos.

   

• Conclusión. Incidencias.

En esta práctica mi grupo de inmunoglobulina A hemos usado el tubo 5 que corresponde a Sofía.

No hemos tenido ninguna incidencia a lo largo del proceso. Sin embargo una compañeras han tenido que repetir la prueba.

En los resultados se puede interpretar 3 variables:

-Positivo: Dos líneas rojas distintivas.

-Negativo: Una línea roja en el área de control C.

No válido: La línea de control no aparece.

A nosotros nos ha salido el resultado negativo.

  

Practica 4: Lectura de placa inmuno difusión radial de determinación de Ig M, Ig G e Ig A

Lectura de placa inmuno difusión radial de determinación de Ig M, Ig G, Ig A (10/10/2019)

• Objetivo:

En esta práctica lo que se pretende obtener es la determinación de la proteína por inmunodifusión radial ya que la proteína que se desea analizar, al difundir en gel de agarosa en el que se ha disuelto el anticuerpo específico, forma un inmunocomplejo visible como un anillo alrededor del pocillo de siembra.

• Fundamento:

La proteína que se va a analizar, al difundir por el gel de agarosa en el que se ha disuelto el anticuerpo específico forma un inmunocomplejo visible como un anillo alrededor del pocillo de siembra. 

El diámetro de este analito es proporcional a la concentración de la proteína analizada.

Esta proporcionalidad está en función del tiempo de migración.

• Materiales:

-Gradilla

-Tubos Eppendorfs que contienen suero.

-Placa (Ig A, Ig M, Ig G)

-Micropipeta (Dispensamos 1 microlitro)

-Puntas blancas de micropipetas

-Recipiente para depositar las puntas usadas

-Soporte de pipetas

• Procedimiento:

Esta práctica la hemos realizado como las anteriores por grupos de inmunoglobulinas. Lo que hemos hecho en primer lugar ha sido ver en que consistía la práctica con ejemplo de la profesora y así poder entenderlo. Después cada grupo ha realizado la técnica en sus respectivas placas. Estas estuvieron atemperándose nada más que llegamos del recreo.

A continuación lo que hicimos fue preparar los materiales mencionados anteriormente.

Una vez todo listo procedimos de manera que tomamos 1 microlito de cada uno de los sueros contenidos en los 5 tubos Eppendorfs y depositarlos en los pocillos de siembra de la placa, a nivel de la Ig A, Ig M y de la Ig G. Cuando ya habíamos depositado el volumen de suero en todos los pocillos de la placa tuvimos que dejarlo reposar. 

El tiempo de difusión y con ello el tiempo de lectura depende de la concentración y del tipo de la proteína analizada. En general, después de 72 horas, la difusión de cualquier proteína habrá finalizado.

Nosotros lo hicimos el jueves 10 y lo hemos revisado el lunes 14. 

• Conclusión. Incidencias.

Pasado los tres días hasta revisar las placas y hacer la correspondiente lectura, mi grupo de inmunoglobulina A y yo nos hemos dado cuenta de que apenas se puede ver o cuantificar del diámetro formado alrededor de cada pocillo de siembra. Esto no solo ha ocurrido a mi grupo y se ha llegado a la conclusión de que quizás depositamos poco volumen de suero. En el protocolo indicaba 5 microlitros pero hubo compañeras que lo intentaron y se salía del pocillo, entonces optamos por tomar 1 microlitro y pensamos que nos hemos quedado corto.

El resultado que hemos obtenido mi grupo y yo al realizar la placa ha sido el siguiente:

Inmunoglobulinas	Pocillo 1	Pocillo 2	Pocillo 3	Pocillo 4	Pocillo 5
Ig A	No se puede leer	4 mm.	4 mm.	4 mm.	3 mm.
	Pocillo 6	Pocillo 7	Pocillo 8	Pocillo 9	Pocillo 10
Ig G	No se puede leer	3 mm.	4 mm.	3 mm.	4 mm.
	Pocillo 11	Pocillo 12	Pocillo 13	Pocillo 14	Pocillo 15
Ig M	No se puede leer	No se puede leer	No se puede leer	3 mm.	3 mm.

Práctica 3: Extracción de suero a partir de una muestra de sangre

             Extracción de suero a partir de una muestra de sangre (3/10/2019)

• Objetivo:

El objetivo de esta práctica es conseguir obtener muestras de suero sanguíneo a partir de una muestra de sangre. Con esto lo que nos aporta es más seguridad y comodidad en técnicas de pipeteo por ejemplo y reforzar aquellos procesos que ya sabemos.

• Fundamento:

Esta técnica se basa en el concepto de suero sanguíneo. Este es el componente de la sangre que se obtiene al dejar la sangre, tras su centrifugación, coagular. Al eliminar el coágulo resultante.

• Materiales:

-Algodón

-Jeringuilla

-Aguja

-Alcohol 96º

-Ligadura

-Tubo de bioquímica amarillo sin anticoagulante (Nosotros hemos usado tubos de ensayo)

-Centrífuga

-Pipetas Pasteur estériles

-Gradillas para tubos de extracción sanguínea

-Gradillas para tubos Eppendorf

-Guantes

-Papel de filtro

• Procedimiento:

1. Extraemos sangre periférica y la recogemos en el tubo de extracción sanguínea, en nuestro caso tubos de ensayo con su gradilla correspondiente.
2. Dejar el tubos, nosotros obtuvimos 5, en la gradilla durante unos 30 minutos para favorecer la coagulación dado que después hay que extraer el coágulo.
3. Centrifugamos los tubos de sangre sin anticoagulante a 1500 g durante 15 minutos.
4. La fracción superior o sobrenadante tras la centrifugación que se observa con un aspecto claro y transparente y de un color amarillento, es el suero sanguíneo.
5. Después de la centrifugación, aspiramos cuidadosamente el sobrenadante, con la ayuda de una pipeta Pasteur, intentando en una aspiración. Alicuotar 0,5 ml del aspirado y depositamos en un tubo Eppendorf.
6. Conservar el suero en el tubo Eppendorf a 4ºC.

   

• Conclusión. Incidencias.

Esta práctica ha sido muy interesante ya que nunca había visto realmente cómo extraer suero. En general a mi grupo y al resto de mis compañeros les ha salido. La dificultad que tuvimos fue que los tubos tardaron en coagularse mas de 30 minutos y al principio no sabíamos el por qué. 

Práctica 2: Hemólisis con agua estilada de eritrocitos

 Hemólisis con agua destilada de eritrocitos (3/10/2019)

• Objetivos:

Esta práctica nos quiere informar más sobre las características de los eritrocitos y de su importancia cuando está en contacto con agua destilada y cuando lo está por ejemplo con suero fisiológico.

En ambas situaciones lo que va a ocurrir es diferente.

• Fundamento:

La práctica se basa en el fundamento del concepto de la hemólisis. Este concepto quiere decir la desintegración de los glóbulos rojos. Los eritrocitos o glóbulos rojos carecen de núcleo y orgánulos, por lo que no puede repararse y finalmente se lisan.

• Materiales:

1. Papel de filtro.
2. Reloj.
3. Centrífuga.
4. Rotulador de vidrio.
5. Tubos de ensayo.
6. Tubos de ensayo para centrífuga (cónicos).
7. Papel Para-film.
8. Gradilla.
9. Pipetas Pasteur de vidrio.
10. Vaso de precipitado.
11. Frasco lavador.
12. Agua destilada.
13. Suero fisiológico.
14. -Sangre venosa anticoagulada.

• Técnica:

Esta técnica consiste en poner en contacto una muestra de sangre por un lado con agua destilada y por otro lado con suero fisiológico y ver qué le ocurren a los eritrocitos.

La sangre cuando se pone en contacto con el agua destilado sufre la hemólisis de los eritrocitos. Esto sin embargo no ocurre en caso de mezclar la sangre con suero fisiológico.

En ambos casos, para ver el resultado previamente hay que centrifugar los tubos.

Elaboración propia

• Conclusión:

El resultado de la hemólisis que hemos obtenido se debe a que el agua no tiene la misma concentración de solutos que el plasma sanguíneo y en cambio el suero salino si se encuentra en las mismas condiciones que el plasma sanguíneo.

Fuente:

http://deliamm96cuadernopracticashema14.blogspot.com/2015/03/practica-estudio-de-la-fragilidad.html

Memoria digital de prácticas de técnicas e inmunodiagnóstico 2º LCB I.E.S. Santa Bárbara

                               1ª Evaluación

           

Índice:

• Práctica 1: Extracción de sangre
• Práctica 2: Hemólisis
• Practica 3: Extracción de suero
• Práctica 4: Inmuno difusión radial
• Práctica 5: Hepatitis B
• Práctica 6: Grupo sanguíneo
• Práctica 7: Reacción de Ouchterlony
• Práctica 8: Factor reumatoide
• Práctica 9: Determinación de Marihuana
• Práctica 10: Determinación de Clamidia
• Práctica 11: Determinación de la hormona Gonadotropina
• Práctica 12: Técnica Ficoll
• Práctica 13: Determinación de Helicobacter pylori
• Práctica 14: Determinación de Giardia lamblia
• Práctica 15: Determinación de Rotavirus

Sheila Villegas García....................................................................................................2ºL.C.B.